NTRK融合遺伝子の検出

検査法の概要

様々な方法でNTRK融合遺伝子やNTRK融合タンパクを検出することができます1

 

融合遺伝子の検出能力は検査法によって異なります2

融合遺伝子の検査方法 融合遺伝子の検査方法

NGSはゲノム鎖を同時に配列決定できるハイスループット技術です7

  • 単一検体中における複数の潜在的にアクショナブルな遺伝子を同時に調べる7,8
  • ブレークポイントまたは融合パートナーに関係なく、ライブラリー調製法2に応じて3つのNTRK遺伝子 （NTRK1、NTRK2またはNTRK3） のいずれかと遺伝子パートナー（既知または新規）との融合を検出
    • 新規融合パートナーの検出にはハイブリッドキャプチャー法を使用したライブラリー調製が必要9,10
    • アンプリコンベースの調製は既知の融合パートナーのみを検出するが、必要とされる核酸量が少ない場合がある11
  • NGS法にはDNAベースおよびRNAベースの方法があるが、NTRK融合遺伝子2の長いイントロン領域におけるシーケンスの問題を回避できるため、RNAベースの方法が優れている

IHCは病理組織切片中のタンパク質を可視化する技術です

  • NTRK融合遺伝子により産出される可能性のあるTRKタンパク質の発現を検出3,12
  • 単一検査としての特異性が低いため、確認用としてNGS検査をする必要がある12,13
  • Pan-TRK IHCは、野生型TRKタンパク質14に加えて、TRKA、TRKB、TRKCの3つの融合タンパク質すべてを検出できる

FISHはインタクトな染色体上の転座、増幅、欠損の検出を可能にするDNAベースの技術です
ブレークアパートプローブに起因する蛍光により組織内の融合遺伝子の可視化が可能です4,15

  • 3種類のブレークアパートプローブが必要（各NTRK遺伝子に1セット）13
  • 既知の融合遺伝子に特異的なプローブセットを使用（例：ETV6-NTRK3）13
  • ブレークアパートプローブの使用で、新規融合パートナーの検出が可能13

RT-PCRはRNAテンプレート上であらかじめ設計された対象領域を標的増幅する方法です
生成物はゲル電気泳動やリアルタイム定量PCRを含む多くの下流技術を用いて可視化され、がん細胞の薬剤に対する反応をモニターするために使用することができます16

  • 多くの検査施設で採用されている高感度な方法16
  • 既知の融合パートナーのみを検出し、新規融合パートナーは検出されない13,17 
  • 長いイントロン全体の増幅が困難16,17 
NTRK遺伝子の融合を検出する方法は複数存在しています。 RNAベースのNGSは、多くの既知および新規の融合パートナーやNTRK融合遺伝子を同定できるため、理想的とされています8

References

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NGS検査

NTRK融合遺伝子を検出するための主な留意事項
  • RNAベースのNGSはDNAベースのNGSに比べて、フレーム内の転写された融合遺伝子とフレーム外の転写された融合遺伝子を区別でき、NTRK融合遺伝子に関連する大きなイントロン領域のシークエンスを回避できるため有効1,2

利点

  • 複数の標的を同時に解析1,3,4
  • RNAベースのNGSは転写されたキメラ融合体のみを同定するため、不安定ながんでは特に有利であり、DNAベースのNGSと比較してより高速なシーケンスプロセスを有する1,5,6

欠点

  • 検出能力がシークエンス・ライブラリー調整方法（ハイブリッドキャプチャー法とアンプリコン法）によって異なる1
  • より長いターンアラウンドタイム1,3,7,8
  • バイオインフォマティクス専門家による解釈が必要1,8

検査ワークフローの概要3,9

  • 核酸抽出（各種検体からの抽出） 
  • 対象領域の同時増幅（ハイブリッドキャプチャーとアンプリコンベースの標的濃縮） 
  • 大規模並列シーケンシング（大量のDNA断片を同時に読み取る） 
  • 配列解析（複雑なバイオインフォマティクス解析）
  • ・コンピュータソフトウェアによるアライメント、ノイズフィルタリング、参照ゲノムとの配列比較

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  • Gagan J, Van Allen EM. Genome Med. 2015;7(1):80. Return to content

IHC検査

NTRK融合遺伝子を検出するための主な留意事項
  • Pan-TRK IHCは、野生型TRKタンパク質に加えて、TRKA、TRKB、TRKCの3つの融合タンパク質すべてを検出することができる1
  • TRKタンパク質の強陽性染色は、NTRK融合遺伝子の存在以外も原因と考えられることから、検査の特異度に影響を与えることがある2
  • がんの中には、野生型TRKタンパク質の高い生理的発現を伴うものがあり、融合遺伝子の結果ではないことがある2,3

利点

  • 迅速に検査することができる1,4
  • 多くの検査室で採用されており、がんの診断法として確立している1,2

欠点

  • 検査が陽性かどうかを判断するには、染色の程度や強度を正しく評価する必要があるため、経験豊富な病理専門医による評価が必要2
  • 検査プロセス（分析前、分析、分析後）が標準化されていない2
  • TRK融合タンパク質に対する特異性が低い3
IHCはタンパク質の発現を測定する検査であるため、その異常発現が融合タンパク質と野生型TRKタンパク質のいずれと関連しているのかを、NGSを用いて確認する必要があります2

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FISH検査

NTRK融合遺伝子を検出するための主な留意事項
  • 遺伝子再構成ががん融合遺伝子につながるかどうか、確立していない1
  • 3つの遺伝子 (NTRK1、NTRK2およびNTRK3) に関連したNTRK融合遺伝子パートナーが多様に存在するため、FISH法で全ての遺伝子を検出するには煩雑な可能性がある1

利点

  • 少ない検体量でゲノム変化を検出することが可能1
  • FISH法はコピー数異常や転座・融合遺伝子の検査法として、多くの検査室で採用されており、検査法としては確立されている1

欠点

  • 評価対象の遺伝子の再構成のみを検出する1
  • ブレークアパートFISHプローブは新規融合パートナーを検出する可能性があるが、特異性は低い1,2
  • 既知の融合パートナーを検出するFISHアッセイでは、他のバリアントや新規融合パートナーを検出することができない1
FISH法では再構成が機能的な融合遺伝子かどうか確認することはできないため、結果を注意して解釈する必要があります。NTRK遺伝子は融合パートナーの範囲が広いため、それぞれの融合パートナーを検出する場合は個別に検出する必要があり、非常に手間がかかる場合があります1

References

  • Church AJ, Calicchio ML, Nardi V, et al. Mod Pathol. 2018;31(3):463-473. Return to content
  • Cheng L, Zhang S, Wang L, MacLennan GT, Davidson DD. J Path Clin Res. 2017;3(2):73-99. Return to content

RT-PCR検査

NTRK融合遺伝子を検出するための主な留意事項
  • 特定のNTRK融合遺伝子（例えばETV6-NTRK3）の検出に関連した検査法である1-3
  • 一般的には融合パートナーの情報を必要とし、長いイントロンを全体で増幅することは困難である4,5 

利点

  • 迅速で高感度な検査である4
  • アッセイを多項目化して1回の検出で様々な変異をカバーすることができる4

欠点

  • アッセイプローブは、特定の融合の組み合わせごとに設計する必要がある1,5
  • 検体中に増幅阻害物質が存在する可能性がある4
RT-PCRは、特定のがんの適応症に関連した特異的な融合遺伝子の検査法として既に使用されていますが、新規の融合パートナーを検出することはできません1

References

  • Church AJ, Calicchio ML, Nardi V, et al. Mod Pathol. 2018;31(3):463-473. Return to content
  • Xu T, Wang, H, Huang X, et al. Transl Oncol. 2018;11(3):609-618. Return to content
  • Vaishnavi A, Le AT, Doebele RC. Cancer Discov. 2015;5:25-34. Return to content
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  • Argani P, Fritsch M, Kadkol SS, Schuster A, Beckwith JB, Perlman EJ. Mod Pathol. 2000;13(1):29-36. Return to content
NTRK融合遺伝子の検出 NTRK融合遺伝子のためのNGSの最適化 検査室での検討事項と運用方法